KV1.3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403814-ACT

KCNA3 codifica per il canale del potassio umano voltaggio-dipendente KV1.3, una conduttanza di membrana che contribuisce a definire il potenziale di membrana a riposo e a modulare la generazione dei potenziali d’azione in cellule eccitabili e non eccitabili. Regolando l’efflusso di potassio, KV1.3 influenza programmi di segnalazione calcio-dipendenti che controllano attivazione, proliferazione e produzione di citochine, collegando l’omeostasi ionica a risposte trascrizionali a valle. L’attività di KV1.3 si intreccia con la segnalazione dei recettori delle cellule immunitarie, la bioenergetica mitocondriale e vie redox-sensibili che modulano le soglie di attivazione cellulare. Un’espressione o funzione disregolata di KCNA3/KV1.3 è stata implicata nell’infiammazione immuno-mediata e in stati proliferativi alterati, supportandone la rilevanza per studi meccanicistici in immunologia e nei fenotipi cellulari associati a malattia.

KV1.3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KV1.3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KV1.3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KV1.3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KV1.3 nelle cellule tumorali con espressione di KCNA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.