KGA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402575-ACT

Il gene umano **GLS** codifica la glutaminasi; l’isoforma di tipo renale **KGA** catalizza la conversione mitocondriale della glutammina in glutammato e ammoniaca, un passaggio chiave della glutaminolisi. Questa reazione supporta l’anaplerosi del ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA), la gestione dell’azoto e la biosintesi di nucleotidi, amminoacidi e glutatione, collegando l’attività di GLS all’equilibrio redox e alle risposte cellulari allo stress. KGA si integra con programmi di sensing dei nutrienti come la segnalazione di **mTORC1** e interagisce con la regolazione metabolica guidata da **MYC**, modellando proliferazione e sopravvivenza in condizioni di disponibilità nutritiva variabile. Un’espressione o attività deregolata di GLS/KGA è stata associata a rimodellamento metabolico nel cancro e ad alterata omeostasi del glutammato in contesti neurologici e infiammatori, rendendola un nodo centrale per studi meccanicistici di fenotipi dipendenti dal metabolismo.

KGA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KGA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KGA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KGA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KGA nelle cellule tumorali con espressione di GLS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.