IRE1α Double Nickaseプラスミド (m): sc-429758-NIC

マウスのErn1はIRE1αをコードしており、IRE1αは小胞体（ER）膜貫通型のキナーゼ／エンドリボヌクレアーゼとして、アンフォールドタンパク質応答（UPR）の中枢センサーとして機能する。ERストレスが生じるとIRE1αはオリゴマー化し、Xbp1 mRNAのスプライシングを活性化して転写因子XBP1sを産生すると同時に、IRE1依存的分解（RIDD）を作動させてER関連転写産物を再編する。PERKおよびATF6経路とのクロストークを介して、IRE1αはプロテオスタシス、分泌経路の処理能力、脂質代謝、オートファジー、炎症性シグナル伝達を協調的に制御する。IRE1α–XBP1シグナルの破綻は、代謝ストレス、神経変性、免疫細胞分化、腫瘍微小環境への適応に関与するとされ、Ern1はERストレス応答の機構研究における重要な結節点となっている。

IRE1α ダブルニカースプラスミド（m）は、mouse 細胞株における Ern1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、Ern1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、Ern1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、Ern1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。