IRAK-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421100-ACT

Irak1 codifica la chinasi 1 associata al recettore dell’interleuchina-1 (IRAK-1), una chinasi serina/treonina che agisce come trasduttore prossimale del segnale a valle del recettore dell’IL-1 e di molti recettori Toll-like. In seguito all’attivazione del recettore, IRAK-1 partecipa alla segnalazione dipendente da MyD88 promuovendo l’attivazione delle vie NF-κB e MAPK, plasmando programmi trascrizionali che regolano la produzione di citochine, l’attivazione delle cellule immunitarie innate e il controllo del feedback infiammatorio. Nei modelli murini, un’alterata attività di IRAK-1 è stata collegata a una segnalazione infiammatoria disregolata e a fenotipi immunitari rilevanti per studi su autoimmunità, biologia delle infezioni e danno tissutale associato all’infiammazione. IRAK-1 viene inoltre spesso studiata nel contesto del cross-talk tra la segnalazione TLR/IL-1R, le risposte all’interferone e le cascate di chinasi attivate dallo stress.

IRAK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Irak1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IRAK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Irak1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Irak1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IRAK-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Irak1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IRAK-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IRAK-1 nelle cellule tumorali con espressione di Irak1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.