Insulin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400149-ACT

Il gene umano **INS** codifica l’insulina, un ormone peptidico sintetizzato come preproinsulina nelle cellule β pancreatiche e processato tramite il traffico secretorio RE–Golgi in insulina matura e peptide C. Il legame al recettore dell’insulina attiva le vie di segnalazione PI3K–AKT e MAPK, coordinando l’assorbimento del glucosio, il metabolismo del glicogeno e dei lipidi e programmi anabolici più ampi in fegato, muscolo e tessuto adiposo. La deregolazione dell’espressione di **INS**, della maturazione della proinsulina o della segnalazione insulinica contribuisce all’alterazione dell’omeostasi del glucosio ed è centrale nella fisiopatologia del diabete e nelle risposte di stress delle cellule β. **INS** è inoltre ampiamente utilizzato come marcatore di identità endocrina e dell’accoppiamento stimolo-secrezione in modelli di sviluppo del pancreas, infiammazione metabolica e differenziamento cellulare.

Insulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Insulin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Insulin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Insulin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Insulin nelle cellule tumorali con espressione di INS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.