Ihh Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401466-ACT

Indian hedgehog (IHH) codifica o morfógeno secretado Ihh, um ligante da família Hedgehog que regula decisões de destino celular e a padronização de tecidos ao ativar a sinalização PTCH1/SMO e a transcrição dependente de GLI. Ihh é um coordenador-chave da ossificação endocondral, da proliferação e hipertrofia de condrócitos e da diferenciação de osteoblastos, integrando-se a programas de desenvolvimento que moldam o crescimento esquelético. A atividade desregulada da via IHH está associada ao desenvolvimento anormal de cartilagem e osso e tem sido implicada em processos patológicos que envolvem desequilíbrio na sinalização Hedgehog. Como os efeitos da via Hedgehog se cruzam com sinais de WNT, BMP e MAPK, o IHH é frequentemente estudado como um indutor a montante da diferenciação e da sinalização do microambiente em modelos musculoesqueléticos e de desenvolvimento.

Ihh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IHH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ihh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IHH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IHH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ihh. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IHH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ihh no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ihh em células tumorais com expressão de IHH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.