IFIT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403066-ACT

La proteina indotta dall’interferone con ripetizioni tetratricopeptidiche 1 (IFIT1) è il prodotto di un gene stimolato dall’interferone che si lega a RNA virali e ad RNA con cappucci anomali, inclusi quelli con 5′-trifosfato e strutture cap0, per limitare la traduzione e potenziare le difese immunitarie innate. IFIT1 agisce nell’ambito della segnalazione dell’interferone di tipo I/III a valle dell’attivazione di JAK–STAT, integrandosi con le vie dei recettori di riconoscimento del pattern (PRR) come RIG-I/MDA5 e TLR3 per plasmare lo stato antivirale. Attraverso interazioni con il macchinario di inizio della traduzione e con altri membri della famiglia IFIT, modula il metabolismo dell’RNA e i programmi di sintesi proteica durante l’attivazione immunitaria. Un’espressione deregolata di IFIT1 è stata associata a risposte antivirali alterate e a firme trascrizionali infiammatorie osservate in infezioni, interferonopatie e microambienti tumorali immuno-correlati, rendendola un marcatore utile e un nodo meccanicistico per la ricerca in immunologia e virologia.

IFIT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IFIT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IFIT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IFIT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IFIT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IFIT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IFIT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IFIT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IFIT1 nelle cellule tumorali con espressione di IFIT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.