HSP70-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417733-ACT

HSPA1B codifica a chaperona induzível HSP70-2, um componente central da resposta celular ao choque térmico que preserva a proteostase durante estresse proteotóxico. A HSP70-2 liga-se a regiões hidrofóbicas expostas em proteínas recém-sintetizadas ou mal dobradas para promover o redobramento, evitar a agregação e facilitar decisões de triagem entre redobramento e degradação por meio do sistema ubiquitina–proteassoma e da autofagia. Ao coordenar-se com co-chaperonas e com a sinalização de fatores de choque térmico, a HSP70-2 influencia a apoptose, a sinalização inflamatória e a recuperação de estresse oxidativo, térmico e associado ao RE. Alterações na atividade da rede HSP70 têm sido associadas a fenótipos relevantes para a sobrevivência de células tumorais, neurodegeneração e citotoxicidade induzida por estresse, tornando o HSPA1B um ponto útil para estudos mecanísticos de adaptação ao estresse.

HSP70-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HSPA1B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HSP70-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HSPA1B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HSPA1B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HSP70-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HSPA1B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HSP70-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HSP70-2 em células tumorais com expressão de HSPA1B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.