HSP 75 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402640-ACT

TRAP1 (HSP 75) è uno chaperone mitocondriale della famiglia HSP90 che regola il ripiegamento delle proteine e il controllo di qualità all’interno della matrice mitocondriale, sostenendo l’integrità della catena respiratoria e la tolleranza cellulare allo stress. Modulando la transizione di permeabilità mitocondriale, l’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno e i flussi bioenergetici, TRAP1 collega l’attività di chaperone all’adattamento metabolico e alle vie della proteostasi. Il rimodellamento della funzione mitocondriale dipendente da TRAP1 è stato associato a una diversa sensibilità all’apoptosi, a risposte allo stress ossidativo e a spostamenti tra fosforilazione ossidativa e glicolisi in molteplici contesti cellulari. Un’espressione o un’attività di TRAP1 deregolate sono state associate alla biologia tumorale, alla neurodegenerazione e ad altri disturbi in cui la disfunzione mitocondriale e lo stress proteotossico contribuiscono alla patologia.

HSP 75 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRAP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSP 75 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRAP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRAP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSP 75. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRAP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSP 75 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSP 75 nelle cellule tumorali con espressione di TRAP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.