HMG-1/HMGB1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400735-ACT

HMGB1 (HMG-1) é uma proteína abundante, não histónica, associada à cromatina, que se liga a estruturas de DNA distorcidas e regula a dinâmica dos nucleossomas, programas de transcrição e a reparação do DNA. No núcleo, contribui para a estabilidade do genoma ao participar em processos ligados às respostas ao stress de replicação, à reparação por excisão de bases e à reparação de quebras de dupla cadeia, ao mesmo tempo que modula a inflamação quando é libertada para o meio extracelular como um padrão molecular associado a dano (DAMP). A HMGB1 influencia a sinalização de NF-κB e MAPK e pode cruzar-se com vias de autofagia e morte celular através de interações com parceiros como o RAGE e recetores da família TLR. A desregulação da expressão ou da localização de HMGB1 tem sido associada à biologia tumoral, a condições neuroinflamatórias e à inflamação estéril, tornando-a um alvo amplamente utilizado em estudos mecanísticos de regulação da cromatina e sinalização de stress.

HMG-1/HMGB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HMGB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HMG-1/HMGB1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HMGB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HMGB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HMG-1/HMGB1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HMGB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HMG-1/HMGB1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HMG-1/HMGB1 em células tumorais com expressão de HMGB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.