HADHB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403234-ACT

HADHB codifica la subunità beta della proteina trifunzionale mitocondriale, un componente centrale della β-ossidazione degli acidi grassi a catena lunga che, in concerto con HADHA, catalizza le fasi di idratasi dell’enoil-CoA e di deidrogenasi del 3-idrossiacil-CoA. Questo complesso enzimatico поддержa l’omeostasi energetica convogliando gli acil-CoA a catena lunga verso la produzione di acetil-CoA, collegando il catabolismo lipidico alla respirazione mitocondriale e alla flessibilità metabolica. L’alterazione della funzione di HADHB è associata a disturbi dell’ossidazione mitocondriale degli acidi grassi e a fenotipi di stress metabolico, inclusa una ridotta produzione di energia durante il digiuno o in condizioni di elevata richiesta. Nei sistemi sperimentali, l’espressione e l’attività di HADHB sono comunemente studiate nel contesto del metabolismo mitocondriale, dell’equilibrio redox e delle risposte di segnalazione indotte dai lipidi.

HADHB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HADHB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HADHB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HADHB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HADHB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HADHB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HADHB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HADHB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HADHB nelle cellule tumorali con espressione di HADHB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.