HADHA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402803-ACT

HADHA codifica la subunità alfa della proteina trifunzionale mitocondriale, un complesso multi-enzimatico necessario per la β‑ossidazione degli acidi grassi a catena lunga. HADHA contribuisce alle attività di enoil‑CoA idratasi e 3‑idrossiacil‑CoA deidrogenasi, che supportano la produzione energetica mitocondriale e il catabolismo lipidico, collegando il flusso degli acidi grassi all’equilibrio redox e all’omeostasi metabolica. L’alterazione della funzione di HADHA è associata a difetti dell’ossidazione mitocondriale degli acidi grassi e a stress cellulare legato ai lipidi, rendendola rilevante per studi sul rimodellamento metabolico e sulla disfunzione mitocondriale. Poiché l’ossidazione degli acidi grassi interseca le risposte allo stress ossidativo e il controllo qualità degli organelli, HADHA è spesso analizzata nei pathway che regolano la funzionalità mitocondriale e la segnalazione guidata dai lipidi.

HADHA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HADHA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HADHA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HADHA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HADHA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HADHA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HADHA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HADHA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HADHA nelle cellule tumorali con espressione di HADHA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.