GRP94 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-423491-LAC

Hsp90b1 del topo codifica GRP94 (gp96), uno chaperone della famiglia HSP90 localizzato nel reticolo endoplasmatico (RE) che поддержisce la proteostasi facilitando il ripiegamento e il controllo qualità delle proteine secrete e di membrana, incluse le integrine e molteplici recettori immunitari. GRP94 partecipa alla risposta alle proteine mal ripiegate (UPR) e alla degradazione associata al RE (ERAD), collegando la segnalazione dello stress del RE all’omeostasi del calcio e alla funzione della via secretoria. Poiché GRP94 influenza la presentazione dell’antigene, la segnalazione dell’immunità innata e la maturazione dei recettori di superficie cellulare, l’alterazione dell’attività di Hsp90b1 è spesso studiata in contesti di infiammazione, disregolazione immunitaria e programmi di adattamento allo stress rilevanti per la biologia tumorale.

Le particelle di attivazione lentivirale GRP94 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Hsp90b1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale GRP94 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Hsp90b1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di GRP94. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Hsp90b1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.