GMPPB Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408461-ACT

GMPPB (pirofosforilase B de GDP-manose) codifica uma enzima que gera GDP-manose, um substrato doador central para reações de glicosilação necessárias para o dobramento adequado de proteínas, seu tráfego intracelular e interações com a matriz extracelular. Em células humanas, a GMPPB sustenta as vias de glicosilação N-ligada e de O-manosilação, particularmente importantes para a glicosilação da α-distroglicana e de outras glicoproteínas associadas à membrana. A redução da disponibilidade de GDP-manose pode alterar o processamento entre o retículo endoplasmático (RE) e o complexo de Golgi, comprometer a adesão célula–matriz e perturbar redes de sinalização dependentes da maturação de glicoproteínas. Variantes que afetam a função de GMPPB estão associadas a fenótipos neuromusculares do espectro das distroglicanopatias, tornando este gene relevante para o estudo de mecanismos dependentes de glicosilação na biologia do músculo e do sistema nervoso.

GMPPB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GMPPB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GMPPB O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GMPPB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GMPPB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GMPPB. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GMPPB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GMPPB no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GMPPB em células tumorais com expressão de GMPPB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.