GlyR α1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404734-ACT

GLRA1 codifica a subunidade alfa 1 do receptor de glicina (GlyR α1), um canal de cloreto ativado por ligante que medeia a neurotransmissão inibitória rápida na medula espinal, no tronco encefálico e em outras regiões do SNC. Após a ligação da glicina, o GlyR α1 promove o influxo de cloreto, hiperpolarizando os neurónios e moldando circuitos de controlo motor, o “gating” sensorial e vias do reflexo de sobressalto. A função do recetor é regulada por proteínas de ancoragem sináptica e pela organização das sinapses inibitórias, incluindo interações com a gefirina, que influenciam a agregação (clustering) do recetor e a estabilidade pós-sináptica. Alterações genéticas e funcionais de GLRA1 estão associadas a perturbações da sinalização inibitória, como a hiperecplexia, e a fenótipos mais amplos que envolvem excitabilidade neuronal e disfunção motora.

GlyR α1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GLRA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GlyR α1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GLRA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GLRA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GlyR α1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GLRA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GlyR α1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GlyR α1 em células tumorais com expressão de GLRA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.