GCN2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424196-ACT

O gene murino **Eif2ak4** codifica a **GCN2**, uma quinase de proteína serina/treonina que detecta a limitação de aminoácidos ao se ligar a tRNAs não carregados e inicia a resposta integrada ao estresse. Quando ativada, a GCN2 fosforila a **eIF2α** para reduzir a tradução global, ao mesmo tempo em que promove programas de tradução seletiva, como a transcrição dependente de **ATF4**, conectando o estresse nutricional ao metabolismo adaptativo e ao controle do estado redox. Essa via interage com a sinalização de **mTORC1**, a regulação da autofagia e o controle de qualidade associado ao ribossomo durante desafios de proteostase. A desregulação da sinalização de GCN2 tem sido implicada em fenótipos inflamatórios e metabólicos, em respostas ao estresse associadas à neurodegeneração e na adaptação de células tumorais a microambientes pobres em nutrientes, sustentando seu uso em estudos mecanísticos da biologia do estresse.

GCN2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Eif2ak4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GCN2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Eif2ak4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Eif2ak4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GCN2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Eif2ak4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GCN2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GCN2 em células tumorais com expressão de Eif2ak4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.