GCN1L1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-411545-ACT

O GCN1 humano (GCN1L1) codifica um cofator associado ao ribossomo que conecta o estresse translacional à resposta integrada ao estresse, ao facilitar a ativação da quinase de eIF2α GCN2 durante a limitação de aminoácidos e outros estresses nutricionais relacionados. Por meio desse papel, o GCN1L1 ajuda a coordenar a atenuação global da tradução com programas de tradução seletiva que sustentam a proteostase e a adaptação metabólica. A perturbação da sinalização de estresse regulada por GCN1L1 pode influenciar as saídas transcricionais dependentes de ATF4, a autofagia e as decisões de sobrevivência celular sob condições proteotóxicas ou de privação de nutrientes. A desregulação dessas vias tem sido implicada em contextos como a tolerância de células tumorais ao estresse, defeitos de proteostase associados à neurodegeneração e mecanismos de doenças metabólicas, tornando o GCN1L1 um nó útil para estudos focados em vias.

GCN1L1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GCN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GCN1L1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GCN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GCN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GCN1L1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GCN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GCN1L1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GCN1L1 em células tumorais com expressão de GCN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.