GC-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403599-ACT

OLFM4 (olfactomedina 4), também conhecido como GC-1, codifica uma glicoproteína secretada enriquecida no epitélio gastrointestinal e em compartimentos hematopoéticos, onde marca subpopulações de células-tronco e progenitoras. O OLFM4 participa da homeostase epitelial ao modular a adesão celular, a diferenciação e a sinalização imune inata, com ligações funcionais a programas associados à via Wnt/β-catenina e a vias inflamatórias no nicho intestinal. Alterações na expressão de OLFM4 foram relatadas em diferentes condições inflamatórias intestinais e em múltiplas neoplasias, nas quais é frequentemente estudado como um regulador dependente do contexto da proliferação, da sobrevivência e do remodelamento tecidual. Em sistemas humanos, o OLFM4 é amplamente utilizado para estratificar estados celulares e para investigar mecanismos que governam a função de barreira e fenótipos associados a tumores.

GC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OLFM4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GC-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OLFM4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OLFM4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GC-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OLFM4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GC-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GC-1 em células tumorais com expressão de OLFM4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.