folliculin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403316-ACT

O FLCN humano codifica a foliculina, uma proteína associada à supressão tumoral que atua como proteína ativadora de GTPase (GAP) para RagC/D e ajuda a acoplar a detecção de aminoácidos à sinalização do mTORC1 em lisossomos. A foliculina participa da homeostase energética e de nutrientes por meio de interações com FNIP1/2 e AMPK, influenciando a autofagia, a biogênese lisossomal e o metabolismo mitocondrial. A disrupção de FLCN desregula programas de células epiteliais e estromais ligados à proliferação e diferenciação, e variantes germinativas estão associadas à síndrome de Birt–Hogg–Dubé, caracterizada por patologia renal e pulmonar. Como a foliculina integra a sinalização metabólica e de resposta ao estresse, ela é amplamente estudada em vias que regulam o controle do crescimento celular e a homeostase tecidual.

folliculin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FLCN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

folliculin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FLCN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FLCN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de folliculin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FLCN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de folliculin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via folliculin em células tumorais com expressão de FLCN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.