FMNL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404817-ACT

La proteina 1 simile alla formina (Formin-like protein 1, FMNL1) è un fattore di nucleazione e allungamento dell’actina regolato dalle GTPasi Rho, che sostiene il rimodellamento dinamico del citoscheletro corticale. Contribuisce alla formazione dei filopodi, alla polarità cellulare, all’adesione e alla migrazione coordinando l’assemblaggio dei filamenti di actina a valle di vie di segnalazione come RhoA e Cdc42. FMNL1 è espressa in modo marcato nelle linee ematopoietiche ed è spesso studiata nel contesto del traffico delle cellule immunitarie, della fagocitosi e dell’organizzazione della sinapsi immunologica. Una regolazione alterata del citoscheletro che coinvolge FMNL1 è stata associata a modifiche della funzione leucocitaria ed è stata investigata nella biologia delle malattie infiammatorie ed ematologiche come meccanismo in grado di influenzare la motilità cellulare e l’infiltrazione tissutale.

FMNL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FMNL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FMNL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FMNL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FMNL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FMNL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FMNL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FMNL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FMNL1 nelle cellule tumorali con espressione di FMNL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.