FKRP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404396-ACT

FKRP codifica la proteina fukutin-related, una glicosiltransferasi residente nel Golgi necessaria per la modifica post-traduzionale dell’α-distrogllicano, un recettore chiave che collega la matrice extracellulare al complesso distrofina–glicoproteine. Attraverso il suo ruolo nella glicosilazione O-mannosilata, FKRP sostiene l’integrità della membrana basale e la stabilità del sarcolemma, influenzando il mantenimento delle fibre muscolari e l’organizzazione dei tessuti neuromuscolari. L’alterazione della glicosilazione dipendente da FKRP compromette il legame dei ligandi all’α-distrogllicano ed è fortemente associata a fenotipi di distroglicanopatia, inclusi la distrofia muscolare dei cingoli e sottotipi di distrofia muscolare congenita. In quanto nodo di via che collega la macchina della glicosilazione alla segnalazione della matrice extracellulare, FKRP è ampiamente studiato in modelli di patologia muscolare e di comportamento cellulare dipendente dalla matrice.

FKRP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FKRP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FKRP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FKRP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FKRP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FKRP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FKRP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FKRP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FKRP nelle cellule tumorali con espressione di FKRP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.