Ferrochelatase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402043-ACT

Il gene umano **FECH** codifica la **ferrochelatasi**, un enzima associato alla membrana interna mitocondriale che catalizza l’inserimento del ferro ferroso nella protoporfirina IX per formare l’eme, fase terminale della via di biosintesi dell’eme. Questa attività collega il metabolismo delle porfirine alla gestione del ferro, alla funzione mitocondriale e alla produzione di proteine eme-dipendenti coinvolte nella fosforilazione ossidativa, nelle reazioni del citocromo P450 e nel trasporto dell’ossigeno. La disregolazione di **FECH** altera l’omeostasi dei tetrapirroli e può portare all’accumulo di intermedi porfirinici fotoreattivi, con implicazioni per la fisiologia eritroide ed epatica. In quanto nodo di via metabolica, la ferrochelatasi è ampiamente studiata in contesti che includono stress mitocondriale, equilibrio redox e adattamenti metabolici a una disponibilità alterata di eme.

Ferrochelatase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FECH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ferrochelatase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FECH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FECH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ferrochelatase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FECH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ferrochelatase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ferrochelatase nelle cellule tumorali con espressione di FECH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.