ferritin light chain Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400924-ACT

FTL codifica a cadeia leve da ferritina, um componente central da nanocápsula de ferritina que amortece o ferro lábil intracelular ao armazenar Fe(III) e limitar a geração de espécies reativas de oxigênio catalisada pelo ferro. Ao coordenar o sequestro de ferro com a atividade da cadeia pesada da ferritina e com a ferritinofagia, a FTL ajuda a regular o equilíbrio redox, a função mitocondrial e as respostas celulares ao estresse oxidativo. Alterações na composição da ferritina ou no manuseio do ferro influenciam vias ligadas à suscetibilidade à ferroptose e podem modular a sinalização inflamatória e de estresse metabólico. A desregulação da expressão de FTL tem sido associada a estados de sobrecarga de ferro e a fenótipos neurodegenerativos e hematológicos, nos quais a homeostase do ferro e o dano oxidativo são características biológicas marcantes.

ferritin light chain O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FTL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ferritin light chain O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FTL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FTL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ferritin light chain. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FTL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ferritin light chain no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ferritin light chain em células tumorais com expressão de FTL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.