FAM186A Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-414163-ACT-2

Il gene umano FAM186A codifica una proteina ancora poco caratterizzata, implicata da dati di espressione e di associazione genetica in programmi regolatori specifici di determinati tipi cellulari e nel mantenimento dell’omeostasi tissutale. Sebbene la sua precisa funzione molecolare resti da chiarire, FAM186A viene comunemente studiato nel contesto della segnalazione intracellulare e delle reti di controllo trascrizionale che influenzano la differenziazione cellulare e le risposte adattative allo stress. Varianti o un’espressione deregolata di FAM186A sono state riportate in dataset collegati a tratti di malattie complesse, stimolando l’indagine del suo contributo ai meccanismi patogenetici tramite la genomica funzionale. L’editing genetico di FAM186A consente studi di perdita e acquisizione di funzione, la mappatura delle vie di segnalazione e la profilazione fenotipica in modelli cellulari umani, per chiarire gli effetti a valle sui processi cellulari e su firme molecolari rilevanti per la malattia.

FAM186A Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAM186A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAM186A Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAM186A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAM186A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAM186A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAM186A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAM186A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAM186A nelle cellule tumorali con espressione di FAM186A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.