EXOSC8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405322-ACT

EXOSC8 codifica uma subunidade central do complexo exossomo de RNA humano, uma exorribonuclease multiproteica 3′–5′ que regula o controlo de qualidade e a renovação (turnover) de RNA no núcleo e no citoplasma. Por meio do processamento e da degradação coordenados de rRNA, snRNA, snoRNA e intermediários da degradação de mRNA, a EXOSC8 contribui para vias de vigilância de RNA que mantêm a integridade do transcriptoma e a proteostase. A disrupção da função do exossomo perturba a biogénese ribossomal, a homeostase transcricional e as respostas ao stress, associando a desregulação de EXOSC8 a fenótipos do neurodesenvolvimento e neurodegenerativos descritos para genes associados ao exossomo. Assim, a EXOSC8 é um alvo útil para estudar o metabolismo de RNA, o processamento cotranscricional e os mecanismos de degradação de RNA em células humanas.

EXOSC8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EXOSC8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EXOSC8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EXOSC8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EXOSC8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EXOSC8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EXOSC8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EXOSC8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EXOSC8 em células tumorais com expressão de EXOSC8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.