ERdj4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410882-ACT

O DNAJB9 humano codifica o ERdj4, uma cochaperona Hsp40/DnaJ luminal do retículo endoplasmático (RE) que dá suporte ao controlo de qualidade do dobramento proteico ao estimular a atividade ATPase da BiP/GRP78. O ERdj4 é induzido durante o stress do RE e contribui para os programas da resposta a proteínas mal dobradas (UPR), acoplando o dobramento assistido por chaperonas à degradação associada ao RE (ERAD) para limitar a proteotoxicidade. Por meio dessas funções, o DNAJB9 ajuda a regular a proteostase, a homeostase da via secretora e redes transcricionais adaptativas ao stress. A desregulação da proteostase do RE e da sinalização da UPR envolvendo o ERdj4 tem sido associada, em contextos de investigação, a inflamação, disfunção metabólica e fenótipos de mau dobramento proteico relevantes para a neurodegeneração e a biologia do cancro.

ERdj4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DNAJB9 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ERdj4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DNAJB9 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DNAJB9, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ERdj4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DNAJB9 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ERdj4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ERdj4 em células tumorais com expressão de DNAJB9 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.