ephrin-B2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400777-ACT

EFNB2 codifica per ephrin-B2, un ligando ancorato alla membrana per le tirosin-chinasi recettoriali EphB, che media una segnalazione bidirezionale tra cellule. Le interazioni ephrin-B2/EphB regolano la gemmazione angiogenica, la specificazione arterioso-venosa, il rimodellamento vascolare e i segnali di guida durante lo sviluppo, coordinando la dinamica del citoscheletro, l’adesione e la migrazione cellulare. La segnalazione si interseca con vie che controllano il rimodellamento dell’actina e l’organizzazione delle giunzioni, incluse le GTPasi della famiglia Rho e le reti di fosforilazione a valle che modellano il comportamento endoteliale e perivascolare. Un’attività deregolata di EFNB2 è stata associata ad alterazioni del patterning vascolare e all’angiogenesi associata ai tumori, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici di biologia vascolare e di segnalazione del microambiente.

ephrin-B2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EFNB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ephrin-B2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EFNB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EFNB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ephrin-B2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EFNB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ephrin-B2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ephrin-B2 nelle cellule tumorali con espressione di EFNB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.