Epac Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401807-ACT

RAPGEF3 codifica a Epac (proteína de troca diretamente ativada por cAMP), um fator de troca de nucleotídeos de guanina que conecta a sinalização por cAMP à ativação das pequenas GTPases Rap1 e Rap2. Por meio do controle, dependente de Rap, da afinidade de integrinas, da estabilidade das junções célula–célula e da dinâmica do citoesqueleto, a Epac regula adesão, migração, função de barreira e tráfego vesicular em diversos tipos celulares. A sinalização da Epac cruza-se com vias de cAMP independentes de PKA e integra-se a redes regulatórias de MAPK e PI3K para modular a proliferação e as respostas ao estresse. A atividade desregulada de RAPGEF3/Epac tem sido implicada em processos relevantes para invasão de células tumorais, fenótipos cardiovasculares e inflamatórios e controle metabólico, tornando-a um nó útil para estudos mecanísticos de vias de sinalização.

Epac O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RAPGEF3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Epac O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RAPGEF3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RAPGEF3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Epac. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RAPGEF3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Epac no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Epac em células tumorais com expressão de RAPGEF3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.