EP2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401464-ACT

PTGER2 codifica il recettore umano della prostaglandina E2 (EP2), un recettore accoppiato a proteine G che segnala principalmente tramite Gs, aumentando il cAMP intracellulare e attivando programmi trascrizionali dipendenti da PKA/CREB. EP2 integra i segnali della prostaglandina E2 in vie che controllano l’infiammazione, il tono vascolare, la funzione di barriera epiteliale e il rimodellamento tissutale, con cross-talk a valle con la segnalazione MAPK e PI3K in modo dipendente dal tipo cellulare. Una segnalazione PTGER2/EP2 deregolata è stata associata ad alterazioni nell’attivazione delle cellule immunitarie e nella produzione di citochine, ed è spesso studiata nel contesto della biologia dell’infiammazione cronica, dei processi associati alla fibrosi e della segnalazione nel microambiente tumorale.

EP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTGER2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTGER2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTGER2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EP2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTGER2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EP2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EP2 nelle cellule tumorali con espressione di PTGER2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.