EN1/Engrailed 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420171-ACT

O gene En1 de camundongo codifica EN1/Engrailed 1, um fator de transcrição homeobox que estabelece a identidade posicional e regula programas de padronização durante o desenvolvimento embrionário, com papéis de destaque na formação do limite mesencéfalo–rombencéfalo e na morfogênese do cerebelo. EN1 modula redes de expressão gênica que controlam a especificação neuronal, a orientação axonal e a diferenciação regional, interagindo com eixos de sinalização do desenvolvimento como Wnt, FGF, BMP e SHH, que coordenam decisões de destino do neuroepitélio. Em tecidos pós-natais, EN1 contribui para a manutenção neuronal e a função de circuitos, tornando-o relevante para estudos de fenótipos do neurodesenvolvimento, vulnerabilidade neural e desregulação transcricional. Alterações na expressão de EN1 têm sido investigadas em modelos de malformações do desenvolvimento e em contextos nos quais fatores de transcrição que especificam linhagens são cooptados em programas regulatórios gênicos associados a doenças.

EN1/Engrailed 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de En1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EN1/Engrailed 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus En1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição En1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EN1/Engrailed 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus En1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EN1/Engrailed 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EN1/Engrailed 1 em células tumorais com expressão de En1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.