eIF2C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409888-ACT

AGO1 umano (eIF2C1) codifica una proteina della famiglia Argonaute che è un componente centrale del complesso di silenziamento indotto dall’RNA (RISC), collegando piccoli RNA come miRNA e siRNA alla repressione specifica per sequenza dei trascritti bersaglio. Attraverso il legame guidato da piccoli RNA, eIF2C partecipa alla regolazione genica post-trascrizionale, influenzando la stabilità e la traduzione dell’mRNA e plasmando programmi legati alla differenziazione, alle risposte allo stress e al mantenimento delle reti regolatorie del genoma. Il silenziamento dell’RNA dipendente da AGO1 si intreccia con un controllo epigenetico e trascrizionale più ampio modulando nodi chiave di segnalazione e circuiti di feedback che governano l’identità cellulare. Un’attività disregolata della via Argonaute/miRNA è stata associata a paesaggi di espressione genica alterati osservati in diversi tumori e in condizioni neurologiche e infiammatorie, rendendo AGO1 un utile punto di accesso per analizzare i meccanismi di regolazione dell’RNA.

eIF2C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AGO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

eIF2C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AGO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AGO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di eIF2C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AGO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da eIF2C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via eIF2C nelle cellule tumorali con espressione di AGO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.