EHD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407060-ACT

A EHD1 humana (proteína 1 contendo domínio de homologia Eps15) codifica uma ATPase da família de proteínas EHD que coordena a remodelação da membrana durante a endocitose e a reciclagem de recetores internalizados de volta para a membrana plasmática. A EHD1 regula o tráfego a partir de endossomas tubulares e interage com o transporte mediado por Rab, a dinâmica da actina e a curvatura de membrana dependente de fosfoinositídeos, influenciando a disponibilidade de recetores e a duração da sinalização. Ao controlar a reciclagem de cargas, a EHD1 afeta processos como migração celular, captação de nutrientes e a expressão à superfície de moléculas de adesão e de recetores de fatores de crescimento. Alterações na reciclagem endocítica e nos programas de tráfego de recetores envolvendo a EHD1 têm sido associadas a fenótipos relevantes para sinalização proliferativa e comportamento invasivo na biologia do cancro, bem como a uma desregulação mais ampla do transporte de membrana em contextos de doenças complexas.

EHD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EHD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EHD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EHD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EHD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EHD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EHD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EHD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EHD1 em células tumorais com expressão de EHD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.