EDAR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405342-ACT

EDAR codifica il recettore dell’ectodisplasina A, un membro della superfamiglia dei recettori del TNF che media la segnalazione epitelio–mesenchimale durante lo sviluppo dei follicoli piliferi, dei denti e delle ghiandole sudoripare eccrine. L’attivazione di EDAR dipendente dal ligando coinvolge proteine adattatrici come EDARADD per propagare la segnalazione NF-κB e i conseguenti programmi trascrizionali che controllano la formazione delle placodi, la differenziazione dei cheratinociti e la morfogenesi degli annessi cutanei. Un’attività deregolata della via di EDAR è associata a fenotipi di displasia ectodermica e ad anomalie dello sviluppo che interessano gli annessi della pelle. Nei modelli cellulari umani, EDAR rappresenta un nodo meccanicistico per lo studio della regolazione trascrizionale legata a NF-κB negli epiteli stratificati e nei sistemi di organoidi.

EDAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EDAR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EDAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EDAR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EDAR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EDAR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EDAR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EDAR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EDAR nelle cellule tumorali con espressione di EDAR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.