E-cadherin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400031-ACT

CDH1 codifica per l’E-caderina, un recettore di adesione cellula–cellula calcio-dipendente che forma le giunzioni aderenti tramite legame omofilico e accoppiamento al citoscheletro di actina attraverso le catenine. Stabilizzando l’architettura epiteliale e la polarità apico-basale, l’E-caderina influenza l’inibizione da contatto, la funzione di barriera e la morfogenesi tissutale, e si interfaccia con vie come la segnalazione Wnt/β-catenina che coordinano i programmi trascrizionali con l’integrità delle giunzioni. La perdita, la redistribuzione o il silenziamento trascrizionale dell’E-caderina è frequentemente associato alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), a fenotipi di migrazione e invasione alterati e a stati di differenziazione compromessi. La disregolazione di CDH1 è inoltre rilevante negli studi sulla biologia dei soppressori tumorali e sulla predisposizione ereditaria al cancro, inclusi il carcinoma gastrico diffuso e il carcinoma mammario lobulare, nonché in modelli di metastasi e di sviluppo di organoidi.

E-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

E-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di E-cadherin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da E-cadherin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via E-cadherin nelle cellule tumorali con espressione di CDH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.