DR4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400747-ACT

TNFRSF10A codifica il recettore di morte 4 (DR4), un membro di superficie cellulare della superfamiglia dei recettori del TNF che lega TRAIL per avviare l’apoptosi estrinseca. In seguito al legame con il ligando, DR4 assembla il complesso di segnalazione che induce la morte (DISC), promuove l’attivazione della caspasi-8 e può intersecarsi con l’apoptosi mitocondriale tramite il clivaggio di BID, collegando la segnalazione recettoriale a un controllo più ampio del destino cellulare. L’attività di DR4 è integrata con il crosstalk delle vie NF-κB e MAPK, che possono influenzare la segnalazione infiammatoria e le risposte allo stress, rendendolo un nodo utile per studiare esiti dipendenti dal contesto tra sopravvivenza e morte. Un’espressione alterata di TNFRSF10A o una diversa responsività della via sono state riportate in vari tumori e in contesti correlati al sistema immunitario, a supporto di studi meccanicistici sulla competenza apoptotica, la sorveglianza immunitaria e i fenotipi di resistenza.

DR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNFRSF10A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNFRSF10A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNFRSF10A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DR4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNFRSF10A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DR4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DR4 nelle cellule tumorali con espressione di TNFRSF10A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.