Dnmt1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420033-ACT

O gene Dnmt1 de camundongo codifica a DNA metiltransferase 1, a principal metiltransferase de manutenção, que copia os padrões de metilação em CpG durante a replicação do DNA para preservar a identidade epigenética celular. A DNMT1 atua em redes regulatórias da cromatina juntamente com a UHRF1 e proteínas ligantes de metil-CpG, influenciando a repressão transcricional, o imprinting genômico, a inativação do cromossomo X e o silenciamento de transposons. Ao acoplar a metilação do DNA a modificações de histonas e à montagem de cromatina acoplada à replicação, a DNMT1 ajuda a manter a estabilidade do genoma e programas coordenados de expressão gênica. A atividade ou expressão desregulada de DNMT1 está associada a paisagens de metilação aberrantes implicadas em transformação oncogênica, defeitos do desenvolvimento e fenótipos neurobiológicos, tornando-a um nó central para pesquisas em epigenética e modelos de doença.

Dnmt1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Dnmt1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dnmt1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Dnmt1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Dnmt1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dnmt1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Dnmt1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dnmt1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dnmt1 em células tumorais com expressão de Dnmt1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.