DNAH3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410012-ACT

DNAH3 codifica a cadeia pesada 3 da dineína axonemal, uma ATPase dependente de microtúbulos que contribui para a motilidade e a integridade estrutural dos cílios e flagelos axonemais. Como parte da maquinaria do braço de dineína, o DNAH3 sustenta a geração e a coordenação do batimento ciliar na via cílio/axonema, influenciando o fluxo de fluidos e a sinalização mecanossensorial em tecidos ciliados. A perturbação de componentes da dineína axonemal está amplamente associada a fenótipos relacionados a ciliopatias, incluindo defeitos de lateralidade e infertilidade masculina, e a alteração da função ciliar pode interagir com programas de sinalização do desenvolvimento, como a via Hedgehog. Essas características tornam o DNAH3 um alvo útil para dissecar processos mediados por cílios, dinâmicas do citoesqueleto e relações genótipo–fenótipo em modelos de células humanas.

DNAH3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DNAH3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNAH3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DNAH3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DNAH3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNAH3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DNAH3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNAH3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNAH3 em células tumorais com expressão de DNAH3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.