DNA pol γ Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422341-ACT

Polg codifica a DNA polimerase gama, a polimerase catalítica responsável pela replicação e o reparo do DNA mitocondrial em células de camundongo. A DNA pol γ atua com subunidades acessórias para sustentar a manutenção do mtDNA, conectando a capacidade de fosforilação oxidativa à biogênese mitocondrial, à estabilidade do nucleoide e às respostas ao estresse da organela. A perturbação ou a atividade alterada no eixo POLG está associada à depleção de mtDNA ou ao acúmulo de deleções, o que pode modelar fenótipos de disfunção mitocondrial relevantes para mecanismos de doenças neuromusculares e metabólicas. Por isso, Polg é amplamente usado para investigar a integridade do genoma mitocondrial, a dinâmica da forquilha de replicação e vias de sinalização retrógrada que acoplam defeitos mitocondriais a programas transcricionais nucleares.

DNA pol γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Polg sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Polg em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Polg, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol γ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Polg nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol γ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol γ em células tumorais com expressão de Polg silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.