DNA pol γ Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422341-ACT

Polg codifica la DNA polimerasi gamma, la polimerasi catalitica responsabile della replicazione e della riparazione del DNA mitocondriale nelle cellule di topo. La DNA pol γ funziona insieme a subunità accessorie per sostenere il mantenimento del mtDNA, collegando la capacità di fosforilazione ossidativa alla biogenesi mitocondriale, alla stabilità dei nucleoidi e alle risposte dell’organello allo stress. L’alterazione o la deregolazione dell’asse POLG è associata a deplezione di mtDNA o all’accumulo di delezioni, che possono modellare fenotipi di disfunzione mitocondriale rilevanti per i meccanismi di malattie neuromuscolari e metaboliche. Polg è quindi ampiamente utilizzato per studiare l’integrità del genoma mitocondriale, la dinamica delle forcelle di replicazione e le vie di segnalazione retrograda che collegano difetti mitocondriali a programmi trascrizionali nucleari.

DNA pol γ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Polg senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol γ Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Polg nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Polg, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Polg nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol γ nelle cellule tumorali con espressione di Polg silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.