DNA pol γ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401870-ACT

POLG codifica a DNA polimerase γ, a principal polimerase replicativa nas mitocôndrias, responsável pela replicação e pelo reparo do DNA mitocondrial (mtDNA) em coordenação com a helicase TWNK e a proteína mitocondrial de ligação ao DNA de fita simples. Ao manter o número de cópias do mtDNA e a integridade do genoma, a DNA polimerase γ sustenta a fosforilação oxidativa, a biogênese mitocondrial e a homeostase de nucleotídeos. Alterações na função de POLG estão associadas à depleção de mtDNA e ao acúmulo de deleções, conectando a instabilidade do genoma mitocondrial a fenótipos de doenças neuromusculares e neurodegenerativas. Como a disfunção mitocondrial influencia a apoptose, a sinalização imune inata e o metabolismo celular, POLG é amplamente estudado em vias que acoplam a bioenergética às respostas ao estresse.

DNA pol γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLG sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLG em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLG, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol γ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLG nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol γ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol γ em células tumorais com expressão de POLG silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.