DNA pol γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401870-ACT

POLG codifica la DNA polimerasi γ, la principale polimerasi replicativa dei mitocondri, che esegue la replicazione e la riparazione del DNA mitocondriale (mtDNA) in coordinamento con l’elicasi TWNK e la proteina mitocondriale legante il DNA a singolo filamento. Mantenendo il numero di copie dell’mtDNA e l’integrità del genoma, la DNA polimerasi γ sostiene la fosforilazione ossidativa, la biogenesi mitocondriale e l’omeostasi dei nucleotidi. L’alterazione della funzione di POLG è associata a deplezione di mtDNA e all’accumulo di delezioni, collegando l’instabilità del genoma mitocondriale a fenotipi di patologie neuromuscolari e neurodegenerative. Poiché la disfunzione mitocondriale influenza l’apoptosi, la segnalazione immunitaria innata e il metabolismo cellulare, POLG è ampiamente studiato nei percorsi che collegano la bioenergetica alle risposte allo stress.

DNA pol γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DNA pol γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DNA pol γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DNA pol γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DNA pol γ nelle cellule tumorali con espressione di POLG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.