DNA pol ε A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402290-ACT

POLE codifica a subunidade catalítica A da DNA polimerase ε, uma polimerase replicativa de alta fidelidade essencial para a síntese de DNA da fita líder e para a progressão da fase S. A DNA polimerase ε participa da estabilidade da forquilha de replicação, coordena-se com o complexo helicase CMG e contribui para a atividade intrínseca de revisão (“proofreading”) exonuclease 3′→5′, que limita erros de replicação. Por meio de seu papel na replicação do DNA e na manutenção do genoma, POLE se conecta à sinalização de resposta a dano no DNA e às vias de estresse replicativo que protegem a integridade cromossômica. Alterações na função ou na regulação de POLE estão associadas a um aumento da carga mutacional e a fenótipos de instabilidade genômica, frequentemente investigados em estudos sobre defeitos de replicação associados ao câncer e dependência de reparo de DNA.

DNA pol ε A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol ε A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol ε A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol ε A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol ε A em células tumorais com expressão de POLE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.