DNA Ligase III Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402841-ACT

O LIG3 humano codifica a DNA ligase III, uma ligase dependente de ATP essencial para selar quebras de fita simples no DNA durante o reparo por excisão de bases e para resolver intermediários de reparo na via alternativa de união de extremidades. Por meio de suas funções nucleares e mitocondriais, a DNA ligase III sustenta a integridade do genoma, a manutenção do DNA mitocondrial e a sobrevivência celular sob estresse oxidativo e associado à replicação. A atividade de LIG3 interage com complexos de reparo associados a PARP1 e XRCC1 e influencia os desfechos mutacionais quando a recombinação homóloga é limitada. A expressão desregulada de LIG3 ou a dependência de reparo mediado por LIG3 tem sido relacionada a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia do câncer e para modelos de doenças neurodegenerativas.

DNA Ligase III O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LIG3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA Ligase III O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LIG3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LIG3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA Ligase III. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LIG3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA Ligase III no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA Ligase III em células tumorais com expressão de LIG3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.