DGLUCY Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-413322-ACT

C14orf159 codifica DGLUCY, uma proteína mitocondrial implicada na expressão gênica mitocondrial e na homeostase da cadeia respiratória. Estudos funcionais emergentes associam o DGLUCY à regulação da eficiência da fosforilação oxidativa, a processos ligados ao ribossomo mitocondrial e às respostas celulares ao estresse metabólico. Alterações na atividade de DGLUCY têm sido discutidas no contexto de fenótipos de disfunção mitocondrial, nos quais mudanças na capacidade bioenergética podem influenciar o equilíbrio redox e a suscetibilidade ao estresse. Como resultado, o DGLUCY é de interesse para pesquisas mecanísticas sobre metabolismo mitocondrial, vias de controle de qualidade e estados relevantes para doenças caracterizados por função mitocondrial prejudicada.

DGLUCY O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de C14orf159 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DGLUCY O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus C14orf159 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição C14orf159, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DGLUCY. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus C14orf159 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DGLUCY no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DGLUCY em células tumorais com expressão de C14orf159 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.