DGAT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401735-ACT

La diacilglicerolo O-aciltransferasi 1 (DGAT1) è un enzima localizzato nel reticolo endoplasmatico che catalizza la fase terminale della sintesi dei triacilgliceroli, acilando il diacilglicerolo con un acil-CoA di acido grasso. Attraverso questa reazione “impegnata” nella produzione di lipidi neutri, DGAT1 coordina la biogenesi delle goccioline lipidiche, il buffering degli acidi grassi e l’immagazzinamento energetico cellulare, intersecandosi con il metabolismo dei glicerolipidi e con i programmi di adattamento allo stress del RE. L’attività di DGAT1 influenza l’assemblaggio delle lipoproteine e l’assorbimento intestinale dei lipidi, collegando la sua regolazione alla gestione sistemica dei lipidi. Alterazioni dell’espressione o della funzione di DGAT1 sono state associate a disregolazione metabolica e a fenotipi di stress cellulare indotti dai lipidi, rilevanti nei modelli di ricerca su obesità, insulino-resistenza e steatosi epatica.

DGAT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DGAT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DGAT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DGAT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DGAT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DGAT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DGAT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DGAT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DGAT1 nelle cellule tumorali con espressione di DGAT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.