DDAH II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403032-ACT

Il gene umano **DDAH2** codifica la dimetilarginina dimetilaminoidrolasi II (DDAH II), un enzima citosolico che idrolizza la dimetilarginina asimmetrica (ADMA) e la L-NMMA in citrullina e dimetilammina, regolando così l’attività della nitric oxide synthase e la biodisponibilità dell’ossido nitrico (NO). Attraverso il controllo del metabolismo delle metilarginine, DDAH II si inserisce nella segnalazione endoteliale, nei processi redox-sensibili e nelle vie dell’omeostasi vascolare che influenzano il tono della muscolatura liscia e la segnalazione infiammatoria. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di DDAH2 sono state associate a una compromissione della segnalazione del NO e a fenotipi di disfunzione endoteliale. Questi meccanismi rendono DDAH2 un bersaglio rilevante per lo studio delle risposte allo stress cardiometabolico, dell’infiammazione vascolare e dei programmi cellulari NO-dipendenti in sistemi modello umani.

DDAH II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDAH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDAH II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDAH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDAH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDAH II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDAH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDAH II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDAH II nelle cellule tumorali con espressione di DDAH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.