Cytokeratin 6A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401650-ACT

KRT6A codifica la citocheratina 6A, una proteina dei filamenti intermedi di tipo II che forma eterodimeri con le cheratine di tipo I per costruire il citoscheletro cheratinico negli epiteli stratificati. Contribuisce all’integrità meccanica dell’epitelio, alle risposte cellulari allo stress e all’attivazione dei cheratinociti associata alle ferite, integrandosi con programmi di rimodellamento del citoscheletro che influenzano adesione, migrazione e differenziazione. L’espressione della citocheratina 6A è regolata dinamicamente durante stati iperproliferativi e nella riparazione tissutale, e alterazioni dell’attività di KRT6A sono state collegate a fenotipi di cheratinizzazione e a disfunzioni della barriera epiteliale. Queste proprietà rendono KRT6A un nodo utile per studiare l’omeostasi epidermica, l’assemblaggio della rete di cheratine e le vie di adattamento allo stress dell’epitelio.

Cytokeratin 6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT6A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT6A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT6A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 6A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT6A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 6A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 6A nelle cellule tumorali con espressione di KRT6A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.