CYPOR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402375-ACT

O POR humano codifica a NADPH–citocromo P450 oxidorredutase (CYPOR), uma redutase diflavínica que transfere eletrões do NADPH para enzimas do citocromo P450 microssomal. A CYPOR é um determinante central do metabolismo de xenobióticos e de reações esteroidogénicas, sustentando vias envolvidas na biotransformação de fármacos, no metabolismo do colesterol e dos ácidos biliares e no equilíbrio redox oxidativo no retículo endoplasmático. Ao modular a capacidade catalítica do P450, o POR influencia a variabilidade farmacogenómica e a suscetibilidade celular ao stress por metabólitos reativos. Alterações na atividade do POR têm sido associadas a perturbações na biossíntese de hormonas esteroides e a fenótipos metabólicos ligados a sinalização e desintoxicação dependentes de P450 comprometidas.

CYPOR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CYPOR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CYPOR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CYPOR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CYPOR em células tumorais com expressão de POR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.