CYP27A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402836-ACT

CYP27A1 codifica la sterolo 27-idrossilasi, un enzima mitocondriale del citocromo P450 che catalizza fasi ossidative nella biosintesi degli acidi biliari a partire dal colesterolo e contribuisce al metabolismo di steroli e ossisteroli. Generando intermedi come il 27-idrossicolesterolo, CYP27A1 influenza l’omeostasi del colesterolo, il trasporto lipidico e vie di segnalazione legate alla funzione mitocondriale e alla regolazione metabolica. L’alterazione dell’attività di CYP27A1 è associata a una composizione modificata degli acidi biliari e all’accumulo di steroli, ed è implicata nella malattia ereditaria da accumulo lipidico xantomatosi cerebrotendinea (CTX). Queste funzioni rendono CYP27A1 un bersaglio utile per studiare l’ossidazione mitocondriale degli steroidi, la riprogrammazione metabolica e le risposte trascrizionali guidate dagli steroli nelle cellule umane.

CYP27A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CYP27A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CYP27A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CYP27A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CYP27A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CYP27A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CYP27A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CYP27A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CYP27A1 nelle cellule tumorali con espressione di CYP27A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.