cyclin D1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400047-ACT

CCND1 codifica la ciclina D1, un regolatore chiave della transizione del ciclo cellulare G1/S che si lega e attiva CDK4/6 per promuovere la fosforilazione delle proteine della famiglia RB e il rilascio della trascrizione guidata da E2F. Integrando i segnali mitogenici provenienti da vie come MAPK/ERK e PI3K/AKT, la ciclina D1 coordina gli stimoli proliferativi con l’ingresso nel ciclo cellulare e contribuisce al controllo della replicazione del DNA e delle risposte dei checkpoint. Un’espressione deregolata o l’amplificazione di CCND1 è frequentemente associata a proliferazione aberrante e instabilità genomica in diversi tumori, e un’attività alterata della ciclina D1 è stata inoltre collegata a cambiamenti nei programmi di differenziamento e nel metabolismo cellulare. In quanto nodo del ciclo cellulare sensibile alla regolazione trascrizionale, CCND1 è ampiamente utilizzato per studiare l’accoppiamento tra segnalazione e proliferazione e le dipendenze da vie oncogeniche in modelli cellulari umani.

cyclin D1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCND1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cyclin D1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCND1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCND1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cyclin D1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCND1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cyclin D1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cyclin D1 nelle cellule tumorali con espressione di CCND1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.