CTH Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401134-ACT

A CTH humana (cistationina gama-liase) é uma enzima dependente de fosfato de piridoxal na via de transsulfuração que converte cistationina em cisteína, contribuindo para a biossíntese de glutationa e para a homeostase redox celular. A CTH também gera sulfeto de hidrogênio (H₂S), uma molécula gasosa de sinalização que modula a bioenergética mitocondrial, a sinalização inflamatória e o tônus vascular por meio da persulfidação de proteínas e de mecanismos relacionados baseados em tióis. Ao conectar o metabolismo de metionina/homocisteína à capacidade antioxidante, a atividade da CTH influencia as respostas ao estresse oxidativo e à disponibilidade de nutrientes. A desregulação do metabolismo de aminoácidos sulfurados e da sinalização por H₂S tem sido associada à disfunção cardiometabólica, à neurobiologia e à adaptação de células tumorais, tornando a CTH um nó útil para pesquisas focadas em vias.

CTH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CTH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CTH O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CTH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CTH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CTH. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CTH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CTH no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CTH em células tumorais com expressão de CTH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.