CST Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404388-ACT

SLC35A1 codifica o transportador de ácido siálico CMP (CST), um transportador de açúcares nucleotídicos residente no Golgi que importa CMP–ácido N-acetilneuramínico do citosol para o lúmen do Golgi, a fim de sustentar a sialilação terminal de glicoproteínas e glicolipídios. Ao regular a disponibilidade de ácido siálico ativado para as sialiltransferases, o CST influencia o tráfego proteico, a estabilidade de receptores, o reconhecimento célula–célula e fenótipos de interação imune por meio do controle global da glicosilação. Alterações na atividade de SLC35A1 podem remodelar padrões de sialilação na superfície celular que afetam sinalização, adesão e interações com patógenos, tornando-o relevante para estudos de distúrbios de glicosilação e de mecanismos que conectam a remodelação de glicanos ao estresse celular e a fenótipos associados a doenças.

CST O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC35A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CST O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC35A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC35A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CST. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC35A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CST no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CST em células tumorais com expressão de SLC35A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.